急性炎症是肺部暴露于CNTs的第一个反应。在人体中，肺、胸膜和腹腔内对CNTs沉积的组织反应类似于异物诱导反应，它以明显的急性炎症反应开始，随后是长期或慢性的病理改变，在病变部位有大量巨噬细胞和中性粒细胞浸润并产生大量炎症因子，如白介素-1和白介素-18等。这些炎症因子可以通过刺激成纤维细胞转化为肌成纤维细胞来促进肺纤维化。在对特发性肺纤维化病人的成纤维细胞和正常人的肺成纤维细胞的研究中可以发现，肺纤维化病人的细胞中的纤维化因子显著增多，如α肌动蛋白、纤维黏连蛋白等^[5]。以实验小鼠为例，急性炎症在1 d内迅速出现，并在小鼠暴露CNTs后第7天达到顶点。此后，急性炎症反应逐渐降低，并转变为慢性炎症反应。慢性炎症反应以纤维化和轻度慢性炎症为特征，并在暴露后第28天完全建立，至少持续1年^[6]。CNTs在肺间质、血管周围和支气管周围区域诱导募集的炎症细胞主要是中性粒细胞和巨噬细胞^[4]。在这一阶段，经典活化的M1巨噬细胞是主要的巨噬细胞群体，通过细胞表面标记物CD86和主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）识别并激活。诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的数量增加是M1巨噬细胞的功能标志，表明M1在CNTs急性炎症反应中被激活。

炎症小体作为胞质传感器的关键组成部分，通过检测细胞内外的信号启动先天免疫反应来应对微生物感染和组织损伤。NLRP3炎症小体是研究最为充分的复合物，可被多种病原体、内源性危险信号和环境刺激激活。NLRP3炎症小体的基础结构通常由一个感受器、一个效应蛋白——含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1）和一个接头蛋白——凋亡相关斑点蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）组成。研究发现CNTs可以引起人肺泡巨噬细胞的吞噬作用受损，导致活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）增加，增加的ROS又激活NLRP3与ASC结合，形成一个大的、多蛋白低聚物，或“斑点” ^[7]。近邻的几个pro-caspase-1会在斑点内自裂生成caspase-1。释放出的caspase-1通过促进pro-IL-1β和pro-IL-18的剪切成熟来进一步促进炎症的进行^[8-9]，如图 1。NLRP3炎症小体的激活是炎症反应过程中IL-1β和IL-18的产生所必需的^[10]。CNTs暴露的小鼠中，IL-1α、IL-1β和IL-1R结合，激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，使趋化因子CCL2（MCP-1）、CCL5（RANTES）CXCL2和细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6的编码基因高度表达，从而发挥促炎功能^[11-12]。ROS、MAPK、NF-κB、NADPH氧化酶和炎症小体已被确定为最重要的炎症初始信号。

图  1  NLRP3的激活机制^[13]

核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是调节炎症、免疫反应和肿瘤发生的重要蛋白转录因子。TNF-α、IL-1β和IL-6是众所周知的促炎细胞因子并且调节一系列的生理过程，而NF-κB信号通路则诱导他们的激活^[14]。通常情况下，NF-κB通过控制靶基因的转录，编码宿主对细胞内和细胞外应激反应的关键调节因子或效应因子^[15]。典型的NF-κB信号通路的激活包括NF-κB抑制蛋白IκB的降解与NF-κB异源二聚体p50：p65的释放，以及p50：p65二聚体从细胞质易位到细胞核。在CNTs暴露的肺成纤维细胞和肌成纤维细胞中，抑制蛋白IκB被降解，释放出的p50：p65在丝氨酸276（S276）位点磷酸化并进入细胞核^[16]。p65在丝氨酸276（S276）位点的磷酸化是NF-κB激活和NF-κB依赖的基因表达的关键步骤。p50：p65异源二聚体进入细胞核后，与DNA上的κB结合位点结合，激活靶基因的转录，如图 2-A。因此，p65蛋白的核易位通常被认为是NF-κB激活的一个标志。除核易位外，p65的翻译后修饰在NF-κB激活和功能中也起着重要作用^[17]。NF-κB信号通路的激活被认为是控制疾病或应激条件下炎症反应的最主要事件之一。研究已经证明，由NF-κB调控的两个细胞因子，即组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN），在肺纤维化发展过程中被CNTs显著诱导，并且TIMP1和OPN在促进CNTs诱导的肺纤维化中都发挥了关键作用^[18]。

图  2  CNTs暴露小鼠肺成纤维细胞中可溶性因子激活的信号通路^[36]

在CNTs暴露的人成纤维细胞中CD63和整合素β1的显著活化，并在成纤维细胞表面形成TIMP1/CD63/整合素β1复合物，从而触发细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）的磷酸化和激活来促进成纤维细胞的活化和增殖^[19]。有研究支持了多壁碳纳米管（MWCNTs）诱导的肺纤维化反应当中会涉及TIMP1的诱导，TIMP1通过激活TIMP1/CD63/整合素β1轴和ERK信号通路促进成纤维细胞的激活和增殖^[20]。

OPN又称分泌磷酸化蛋白1（secretphosphoprotein1，SPP1），是一种基质细胞蛋白，作为基质和趋化因子，介导多种生物活性。OPN由活化的T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和树突状细胞分泌。作为一种配体，它与多种受体分子相互作用，包括凝血酶、基质金属蛋白酶、跨膜蛋白（整合素，CD44等），以及细胞外基质（ECM）蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白等^[21]。OPN可以通过促进纤维病灶的形成和增加肺细胞外基质蛋白的产生来促进CNTs诱导的肺纤维化。在细胞和分子水平上，OPN促进了转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达和激活、Smad依赖的TGF-β1信号激活以及CNT暴露肺中细胞外基质蛋白的产生和沉积^[22]。OPN是Smad依赖的TGF-β1信号通路的关键激动剂，但OPN是如何促进TGF-β1信号的作用机制尚未出现更加深入的研究。

研究发现，TGF-β1是成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的有丝分裂因子，介导炎症反应，导致过量的ECM的产生以及TIMPs的合成增加^[22]。OPN在CNTs暴露的肺中被高度诱导，并在TGF-β信号激活和肌成纤维细胞分化中发挥关键作用，以促进CNTs暴露后的纤维化发展^[23]。在分子水平上，TGF-β1已被确定为纤维化最主要的内源性调节因子之一。TGF-β1常在肺纤维化病变中表达升高。在动物模型中，TGF-β1活性的过表达导致持续的肺纤维化，而通过抑制或敲除TGF-β受体抑制TGF-β1信号通路可减轻肺纤维化^[24-25]。TGF-β1表现出多种促纤维化活性，特别是显著地刺激成纤维细胞的增殖和成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，从而直接调节纤维化的发展^[26-27]。在ECM中经常可以检测到由活化的巨噬细胞和成纤维细胞分泌的以潜在复合物形式存在的TGF-β1。在CNTs刺激下，TGF-β1在第7天显著增加，但在第28天显著减少。它与细胞表面的受体结合，并通过Smad依赖的途径诱导主要纤维化基因的转录^[28-29]。

在TGF-β/Smad信号通路中，TGF-β1与TGF-βRII受体结合形成二聚体，随后再与TGF-βRI受体结合形成四聚体复合物，通过活化Smad锚定点蛋白（SARA）募集Smad2/3并使其磷酸化转变为pro-Smad2/3并与Smad 4组成Smad复合物。形成的Smad复合物转移到细胞核中，与其他转录因子协同调节基因转录，使细胞发生上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促进肺纤维化的形成^[30]，如图 2-B。

CNTs可增加成纤维细胞中白细胞分化抗原63（cluster of differentiation，CD63）和整合素β1（integrin β1）的水平。在CNTs暴露的肺成纤维细胞中TIMP1与细胞表面CD63相互作用，随后以CD63依赖的方式与integrin β1结合，导致在成纤维细胞表面形成TIMP1/CD63/integrin β1超分子复合物来调节细胞内信号传导，从而触发Erk1/2的磷酸化和激活^[31]，使成纤维细胞富集、肌成纤维细胞分化、纤维灶形成和ECM沉积。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族（如ERK、p38和JNK）是与细胞膜受体和调节靶点相关的重要酶家族，调控着包括细胞增殖、分化、凋亡和炎症等重要生理过程。近些年研究较为深入的Erk也是MAPK超家族的重要成员，包括两个亚型：Erk1和Erk2，它们可以被一系列细胞生长因子激活，转变成为p-Erk1/2，然后将细胞外信号从细胞表面传递到细胞核，从而促进细胞的增殖和分化，如肺成纤维细胞的增殖和产生细胞外基质（ECM）^[32-33]。已有研究证实，ECM产生过程可能部分通过TGF-β通路的激活来实现，包括TGF-β1诱导的MAPK通路^[34-35]，如图 2-C。

肺纤维化由于没有良好的靶向药物而成为当下医学领域重要且棘手的问题。如何有效、精准、迅速地应对肺纤维化带来的不良病理生理问题以及在分子水平上对其进行有效的抑制和治疗，将会成为未来的热点问题。

对CNTs引发肺部炎症和纤维化机制的研究已经证实了多种免疫细胞、可溶性信号分子和ECM蛋白在这一过程中的激活，并引起了肺部微环境的改变。许多介质、信号通路和细胞过程被认为是肺部炎症和纤维化相互作用的主要机制，并作为暴露于CNTs动物中的疾病致病基础对机体产生了不良影响。这些发现为碳纳米管诱导的不良反应和发病机制提供了新的见解，并进一步为CNTs的暴露监测以及吸入纳米材料引起的肺部炎症和纤维化的药物开发提供了新的靶点，但其发病机制尚未得到完全研究和阐明。本文通过将CNTs诱导肺纤维化的四种重要机制进行衔接与梳理，以期为临床肺纤维化的治疗提供新思路。