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非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指在没有大量饮酒和其他明确的损肝因素如慢性肝病、使用药物等情况下，肝细胞内出现脂肪过度沉积变性的临床病理综合征。NAFLD可导致肝硬化、肝功能衰竭、肝癌或心血管疾病等并发症[1]，是发达国家肝脏疾病和肝源性死亡最常见的原因之一[2]。在我国，NAFLD的患病率由20世纪初期的23.8%增加到2018年的32.9%，现已超过乙型肝炎成为第一大慢性肝病[3]。NAFLD的危险因素复杂多样，通常认为与肥胖、遗传、饮食和环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)等因素相关[4]。近年来，EDCs在NAFLD的发生、发展过程中越来越受到重视，其可对机体的生殖、内分泌和免疫等多种系统造成健康损害[5-6]。研究显示，机体持续暴露于EDCs会增加肝脏内的脂质蓄积，EDCs是导致NAFLD形成的重要原因[7-8]。双酚F(bisphenol F，BPF)即4，4'-二羟基二苯基甲烷(CAS号：620-92-8)，作为EDCs家族中的一员，其在生产中的应用逐渐广泛，近10年在全球范围内的暴露呈上升趋势[9]。研究显示，BPF暴露后会干扰肝脏细胞脂质代谢，促进肝脏脂滴(lipid droplets，LDs)积聚，并诱导NAFLD样改变[10]。
LDs降解不畅是引起NAFLD的主要原因[11]。LDs降解进程包括脂质降解和脂肪酸氧化。前者是脂质降解的起始环节，将脂质水解代谢为游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)输送入血。在肝脏中脂肪酸通过氧化分解产生乙酰辅酶A等物质，经线粒体有氧代谢过程产生能量供机体利用[12]。而当脂肪酸氧化过程异常，过度活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生后，会导致LDs积聚[13-14]。因此，本研究从脂质降解角度，探讨BPF暴露对肝癌组织HepG2细胞脂质降解、脂肪酸氧化、ROS水平三方面的影响，以期阐明其诱发NAFLD样改变的机制。
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人肝癌细胞HepG2(赛百慷，中国)、BPF(Sigma Aldich，美国)、二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific，美国)、鼠抗GAPDH(CMCTAG，美国)、肉碱棕榈酰转移酶1 α(CPT1α)多克隆抗体(ABclonal，中国)、鼠抗PPARα(SANTA CRUZ，美国)、兔抗脂肪三酰甘油脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)(CST，美国)、兔抗激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)(CST，美国)、2'，7'-dichlorofluorescin diacetate(Sigma Aldich，美国)、BodipyTM 493/503(Invitrogen，美国)、DAPI Fluoromount-GTM(翌圣，中国)、Hoechst 33342(碧云天，中国)、MitoTEMPOL(Abcam，美国)。
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HepG2细胞用于构建体外染毒模型，使用含体积分数10%的FBS胎牛血清的MEM basic(1 ×)培养基，培养于恒温细胞培养箱(37 ℃、体积分数5%的CO2)。实验分组设置为对照组(Ctr组)及BPF染毒组(简称BPF组)，染毒组BPF浓度为10 μmol/L(BPF溶于DMSO中配成浓度为100 mmol/L的母液，之后用培养基稀释至工作液浓度10 μmol/L)。待HepG2细胞于培养皿中细胞密度达50%时，分别用不含或含BPF的培养基孵育细胞进行造模，染毒时间为24 h。BPF的染毒条件——浓度(10 μmol/L)和染毒时间(24 h)的依据来源于本课题组既往研究结果[10]。在该条件下，BPF不会造成HepG2细胞的明显损伤。
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HepG2细胞染毒完成后，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗，漂洗后在质量分数为4%的多聚甲醛中静置20 min固定细胞，再次清洗，后按照1∶ 200的比例用PBS稀释BodipyTM 493/503探针，每个玻璃小皿中加150 μL，置于37 ℃培养箱中孵育30 min，注意避光；去除BodipyTM 493/503，用PBS漂洗3次并吸尽PBS后，加入DAPI Fluoromount-GTM染细胞核，使用LSM 700拍摄HepG2细胞LDs荧光。每次实验各组各设置1个玻璃小皿，实验共重复3次。
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将HepG2细胞传代于玻璃小皿培养，待染毒完成后用PBS漂洗，漂洗后按照1∶2 000的比例用MEM basic(1 ×)培养基稀释2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，每皿加入200 μL，置于37 ℃培养箱孵育30 min，注意避光。用PBS漂洗3次后按照1∶250的比例用MEM basic(1 ×)培养基稀释Hoechst 33342，每皿加入200 μL，置于37 ℃培养箱孵育20 min，注意避光。用PBS漂洗3次并吸尽后，往每皿加150 μL PBS，使用LSM 700观察并拍摄总ROS荧光情况。每次实验各组各设置1个玻璃小皿，实验共重复3次。
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将HepG2细胞传代于细胞培养皿培养，待染毒完成后，用RNAiso Plus(Takara Biotechnology，Co. Ltd.)从HepG2细胞中分离总RNA。使用PrimeScriptTM RT Master Mix Kit(Takara Biotechnology)将等量的RNA样本反转录为cDNA。使用SYBRTM Green预混Ex TaqTM(Takara Biotechnology)在Light Cycler 480系统(Roche，Basel，Switzerland)上进行实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。mRNA引物由Realgene生物技术(南京，中国)设计和合成。mRNA引物序列如表 1所示。采用HieffTMqPCR STBR Green Mater Mix(翌圣，中国)，在10 μL反应体积(5 μL HieffTMqPCR STBR Green Mater Mix，0.5 μL miRNA正向和反向引物，0.25 μL cDNA模板，3.75 μL DEPC水)进行miRNA qPCR过程。mRNA表达归一化至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)；实验共重复3次。
表 1 mRNA引物序列
引物名称 引物序列（5' to 3'） 引物序列（5' to 3'） CPT1α TGCTTTACAGGCGCAAACTG TGGAATCGTGGATCCCAAA PPARα CAGAACAAGGAGGCGGAGGTC TTCAGGTCCAAGTTTGCGAAGC ATGL ACCAGCATCCAGTTCAACCT ATCCCTGCTTGCACATCTCT HSL CCGACTGAATCTACGTCCCA TAGGGCTGATCGCTGTATGG GAPDH AGAAGGCTGGGGCTCATTTG AGGGGCCATCCACAGTCTTC -
BPF染毒HepG2细胞后，去除培养基，用PBS漂洗3遍，加入细胞裂解液，冰上裂解10 min。用细胞刮将裂解好的细胞刮落，收集至离心管中，4 ℃下12 000 r/min离心15 min。取上清液，BCA法测定上清液中蛋白浓度后置- 20 ℃保存。蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，转膜，封闭，分别加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后加入相应二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence，ECL)试剂盒显色曝光，Image J软件分析统计条带的灰度值。每次实验各组各设置1个样本，实验共重复3次。
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用Graphpad Prism 8.0软件对实验数据进行统计学分析，两组定量资料比较采用t检验，多组定量资料比较采用单因素方差分析，多组数据间进一步的两两比较选用Dunnett-t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。
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肝脏脂肪分解的启动高度依赖于ATGL和HSL，这两种脂肪酶在调节肝脏脂质代谢的进展中发挥重要作用[15]。通过检测脂解基因(ATGL基因和HSL基因)mRNA水平的表达发现，与对照组相比，BPF组ATGL和HSL mRNA表达减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。通过Western blot，在蛋白层面对ATGL和HSL的表达进行验证，发现与对照组比，BPF组ATGL和HSL的蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P < 0.01)，这一结果与mRNA表达结果一致。见表 2、图 1。
表 2 BPF暴露对HepG2细胞ATGL和HSL的影响
(n = 3) 组别 mRNA表达水平 蛋白表达水平 ATGL HSL ATGL HSL Ctr组 1.001 ± 0.041 1.009 ± 0.020 1.000 ± 0.047 1.000 ± 0.037 BPF组 0.669 ± 0.028 0.764 ± 0.117 0.786 ± 0.040 0.680 ± 0.063 t值 11.60 3.576 5.992 7.601 P值 < 0.001 0.023 0.004 0.002 
图 1 BPF暴露对HepG2细胞ATGL和HSL蛋白表达的影响
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脂质降解后通常经由线粒体氧化代谢产生能量，因而，进一步检测了脂肪酸氧化相关基因PPARα和CPT1α表达的改变。结果显示：暴露于BPF后，HepG2细胞中PPARα和CPT1α的mRNA水平出现下调，差异有统计学意义(P < 0.05)。同样，在蛋白水平对上述基因进行验证，发现BPF暴露后细胞PPARα和CPT1α的蛋白表达下调，差异有统计学意义(P < 0.01)。见表 3、图 2。
表 3 BPF暴露对HepG2细胞脂肪酸氧化相关基因和蛋白的影响
(n = 3) 组别 mRNA表达水平 蛋白表达水平 PPARα CPT1α PPARα CPT1α Ctr组 1.001 ± 0.041 1.009 ± 0.020 1.001 ± 0.022 1.000 ± 0.032 BPF组 0.669 ± 0.028 0.764 ± 0.117 0.819 ± 0.013 0.601 ± 0.085 t值 12.301 7.613 3.250 4.565 P值 < 0.001 0.023 < 0.001 0.002 
图 2 BPF暴露对HepG2细胞脂肪酸氧化相关蛋白的影响
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能量代谢障碍会导致ROS大量产生，有研究显示过量ROS会反馈调节引起LDs积聚[16]。借助2'，7'-Dichlorofluorescin diacetate荧光探针，观察BPF暴露对HepG2细胞ROS水平的影响，发现暴露于BPF后，ROS水平升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。进一步对ROS来源进行判断，通过使用MitoTEMPOL抑制线粒体来源的ROS，并借助脂滴特异性探针BodipyTM 493/503标记发现，相比对照组，BPF暴露组出现LDs积聚，而MitoTEMPOL处理后，BPF诱导的LDs积聚减少，差异均有统计学意义(P < 0.01)。见表 4、图 3(A)、图 3(B)。
表 4 BPF暴露对HepG2细胞ROS水平的影响
(n = 3) 组别 ROS水平 脂滴水平 Ctr组 6.552 ± 0.928 7.409 ± 0.749 BPF组 17.178 ± 2.138 17.444 ± 2.364① Ctr + MitoTEMPOL组 — 7.005 ± 1.257 BPF + MitoTEMPOL组 — 6.058 ± 2.057② t值或F值 7.896 28.612 P值 0.001 < 0.001 注：①与Ctr组比较；②与BPF组比较；“—”表示未测试。 
图 3 BPF暴露对HepG2细胞ROS水平的影响
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BPF作为常见塑料添加剂——双酚A(bisphenol A，BPA)的替代品之一，广泛用于环氧树脂、聚碳酸酯、聚酯树脂、阻燃剂、抗氧剂和表面活性剂等产品的制造[9, 17]。在内分泌干扰效应、生殖毒性等方面，BPF与BPA具有相似的毒性，且其在环境中的分布和在机体内的暴露均呈现较高水平[9, 18-19]。关于BPF引起慢性代谢性疾病的研究在国际上较少，但由于其与BPA的结构、性质高度相似性，可以参考BPA的相关机制进行研究。大多数情况下BPA转化为毒性较小的代谢物，剩余的游离BPA会诱导苯氧自由基的酶促和非酶促反应形成，从而产生各种自由基，如超氧化物、过氧化物和羟基自由基，损伤细胞及组织[20]。也有研究显示，低浓度的BPA会促进HepG2细胞中脂质的蓄积，可能与线粒体功能紊乱、ROS增多、脂质代谢改变以及炎症相关[21]。本课题组前期采用液相色谱-串联质谱法检测发现NAFLD患者血清中BPF水平明显高于健康人；进一步借助气相色谱三重四级杆质谱联用的方法，发现BPF暴露引起小鼠肝脏中多种脂肪酸水平升高，并会干扰肝脏细胞脂质代谢，促进肝脏LDs积聚，诱导NAFLD样改变[10]。基于上述BPF暴露引起的脂质代谢紊乱，本研究从脂质降解的角度发现BPF暴露会降低HepG2细胞脂质降解、减少脂肪酸氧化和增加线粒体来源的ROS水平，从而诱导LDs积聚。
肝脏内脂质分解通常始于水解，其第一步和限速步骤是通过ATGL进行的，该酶催化TGs水解成甘油二酯；随后，HSL催化甘油二酯水解，最终生成FFA，释放入血，完成脂解过程[22]。一旦脂质代谢紊乱就可能导致肝脏中产生脂滴积聚，引起NAFLD样改变[23]。ATGL和HSL是TGs水解的共同限速酶，在脂肪细胞脂质降解中起着至关重要的作用[24]。Lin等[25]发现，BPA处理后的大鼠肝脏中ATGL和HSL mRNA水平降低。本实验中，作为BPA的替代物，BPF的暴露同样引起了ATGL和HSL基因及蛋白表达的显著下降，提示从健康安全考虑的BPA替代物BPF在脂质水解方面与BPA具有类似的作用，减缓了肝脏细胞脂质的水解进程。
高效的脂肪酸氧化是脂质降解及产生能量的重要环节，对于有效降低脂滴的积聚具有重要意义。脂肪酸氧化由PPARα调控，其主要发生在线粒体中，产生ATP为机体提供能量。PPARα在改善氧化应激和肝LDs积聚中起重要作用[26-27]。脂肪酸进入线粒体依赖位于线粒体外膜的CPT1α，CPT1α对脂质代谢的调控有重要作用[28]。本研究发现，BPF暴露后脂肪酸氧化基因(CPT1α基因和PPARα基因)的mRNA水平及其蛋白表达水平均出现明显下降，提示BPF暴露可能导致HepG2细胞脂肪酸氧化能力减弱。研究表明，脂质异常的代谢会产生过量的ROS，氧化应激程度增加，对于NAFLD的发生具有正性调节作用[29]。通过免疫荧光，本研究发现BPF暴露后，细胞中ROS水平明显升高。线粒体是ROS的主要来源[30]，并且基于BPF暴露引发过量ROS产生的现象，因而针对该来源ROS的研究尤为必要。MitoTEMPOL作为线粒体靶向超氧化物歧化酶，具有清除超氧化物和烷基自由基的作用[31]。有研究显示MitoTEMPOL可有效抑制线粒体损伤和过度分裂，改善高脂饮食诱导的肝脂肪变性并减少脂质堆积，抑制炎症反应[32-33]。本研究发现，MitoTEMPOL预孵HepG2细胞后，BPF诱导的LDs积聚显著减少，提示线粒体来源的ROS可能是BPF引起HepG2细胞LDs积聚的重要原因，但其机制仍需深入阐述。
综上所述，BPF暴露降低了HepG2细胞脂质降解、脂肪酸氧化的能力，增加了线粒体来源ROS水平，进一步诱导HepG2细胞中LDs积聚，产生NAFLD样改变。因此，本研究为BPF的“健康安全性”提供了直接证据，亦为其暴露引起的NAFLD样改变的潜在致病机制提供了一定的理论依据。
双酚F引起的脂质降解能力降低引发非酒精性脂肪性肝病脂质积聚的作用研究
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目的 从脂质降解角度，阐述双酚F（bisphenol F，BPF）暴露对肝脏细胞HepG2脂质降解能力、脂肪酸氧化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平三方面的影响。 方法 采用HepG2构建体外染毒模型，通过实时聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、共聚焦显微镜检测及Western blot等实验技术，观察BPF对HepG2细胞的脂质降解途径的影响。 结果 BPF暴露引起HepG2细胞脂质水解限速酶——脂肪三酰甘油脂肪酶及激素敏感性脂肪酶mRNA及蛋白表达减少（P < 0.05）；脂肪酸氧化相关蛋白——肉碱棕榈酰转移酶1α（CPT1α）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）mRNA及蛋白表达降低（P < 0.05），线粒体来源的ROS水平升高（P < 0.01）；最终导致脂滴积聚。 结论 BPF暴露致HepG2细胞脂质降解和脂肪酸氧化能力降低，以及线粒体来源ROS水平升高，可能是造成非酒精性脂肪性肝病样改变发生的重要原因之一。 -
图 3 BPF暴露对HepG2细胞ROS水平的影响
注：(A)为2', 7'-dichlorofluorescin diacetate染色后，BPF暴露对HepG2细胞中总ROS水平的影响；(B)为BodipyTM 493/503染色后，BPF暴露及MitoTEMPOL抑制线粒体来源的ROS后对HepG2细胞中脂滴的影响(比例尺1∶20 μm)。
表 1 mRNA引物序列
引物名称 引物序列（5' to 3'） 引物序列（5' to 3'） CPT1α TGCTTTACAGGCGCAAACTG TGGAATCGTGGATCCCAAA PPARα CAGAACAAGGAGGCGGAGGTC TTCAGGTCCAAGTTTGCGAAGC ATGL ACCAGCATCCAGTTCAACCT ATCCCTGCTTGCACATCTCT HSL CCGACTGAATCTACGTCCCA TAGGGCTGATCGCTGTATGG GAPDH AGAAGGCTGGGGCTCATTTG AGGGGCCATCCACAGTCTTC 
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表 2 BPF暴露对HepG2细胞ATGL和HSL的影响
(n = 3) 组别 mRNA表达水平 蛋白表达水平 ATGL HSL ATGL HSL Ctr组 1.001 ± 0.041 1.009 ± 0.020 1.000 ± 0.047 1.000 ± 0.037 BPF组 0.669 ± 0.028 0.764 ± 0.117 0.786 ± 0.040 0.680 ± 0.063 t值 11.60 3.576 5.992 7.601 P值 < 0.001 0.023 0.004 0.002
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表 3 BPF暴露对HepG2细胞脂肪酸氧化相关基因和蛋白的影响
(n = 3) 组别 mRNA表达水平 蛋白表达水平 PPARα CPT1α PPARα CPT1α Ctr组 1.001 ± 0.041 1.009 ± 0.020 1.001 ± 0.022 1.000 ± 0.032 BPF组 0.669 ± 0.028 0.764 ± 0.117 0.819 ± 0.013 0.601 ± 0.085 t值 12.301 7.613 3.250 4.565 P值 < 0.001 0.023 < 0.001 0.002
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表 4 BPF暴露对HepG2细胞ROS水平的影响
(n = 3) 组别 ROS水平 脂滴水平 Ctr组 6.552 ± 0.928 7.409 ± 0.749 BPF组 17.178 ± 2.138 17.444 ± 2.364① Ctr + MitoTEMPOL组 — 7.005 ± 1.257 BPF + MitoTEMPOL组 — 6.058 ± 2.057② t值或F值 7.896 28.612 P值 0.001 < 0.001 注：①与Ctr组比较；②与BPF组比较；“—”表示未测试。
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