从本质上讲，机体内在生物钟是由时钟基因所控制的，时钟基因表达的节律性改变可以影响生物体的节律活动^[2]。时钟基因形成了一个自主的分子振荡器，调控着一系列钟控基因的表达，从而控制不同组织和细胞的活动及功能。研究发现，目前约有50%的药物以钟控基因的产物为靶点^[16]，约82%的药物靶标蛋白编码基因在转录过程中呈现24 h的节律模式^[17]，而且在各种疾病的治疗干预中，选择合适的给药时机也有利于治疗的结局，如高血压等心血管疾病^[18]、肿瘤化疗的疗效和耐受性^[19]等。也就是说，如果将药物或其他治疗干预调整到一天中的最佳时机，就可以最大限度地提高治疗效果，这种时间疗法(chronotherapy)也是目前正在探索的新治疗方式^[20]。但由于外部和内部很多因素影响着机体和环境节律同步过程，导致了不同个体内部计时系统存在异质性，这使时间疗法需要针对不同个体制定个性化的治疗方案。目前面临的问题是尚无准确高效的办法去评估机体内部的生物钟。除时间疗法外，对航空、航海、航天人员，医务工作者以及轮班人员等具备特殊作息时间和规律的职业人群而言，因作息时间不规律，常导致生物节律紊乱，引起失眠、抑郁等多种身心疾病。若能及早识别特殊作息职业个体的昼夜节律紊乱情况，并开展针对性的干预，不仅能提高医护、航空、航海等特殊职业人员的作业效能，也能避免因节律紊乱导致的身心健康受损及一些安全事故的发生。

要对身体内在计时系统进行准确的评估，就必须依赖于可靠的检测方法。众所周知，昼夜节律系统影响着睡眠-觉醒周期的正常维持，它驱使人们在白天时保持清醒以维持社交活动；当清醒状态延长时，睡眠压力逐渐积累，又会导致困倦进入睡眠^[21]，因此睡眠-觉醒周期是机体昼夜节律最为直接的外在体现，对睡眠-觉醒周期的监测可以间接反应机体的昼夜节律情况。目前，通过神经解剖示踪法、体内和体外连续记录的电生理学等方法已证明下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)通过向室旁核和其他下丘脑核团的神经投射，驱动皮质醇的分泌以及核心体温、血压、心率等的日节律性波动^[22-23]，因此对这些生理指标的监测也成为间接评估机体内部时间的重要方式。而内源性褪黑素作为SCN直接驱动松果体分泌的激素，成为监测机体内部计时系统的金标准^[24]。除此之外，随着代谢组学和转录组学的发展，基于机器学习或数学模型分析的方法，从这些高维数据中提取特征，已经开发出了评估昼夜节律参数的新方法。因此，本文针对确定内在计时系统的应用前景，总结了目前已有和仍处于探索阶段的各种机体内在时钟的检测方法，并探讨各种方法的优缺点，旨在寻找一个预测准确、可操作性强、应用性好的方法去评估机体内在生物钟，并判断机体是否发生昼夜节律紊乱，从而及早识别、干预和治疗。

睡眠日记是评估一个人睡眠习惯的重要工具，它要求每日记录睡眠相关信息，包括上床或熄灯时间、入睡时间、睡眠中断的次数和持续时间、总的睡眠时长、白天的嗜睡和疲劳症状、日常运动、咖啡因或吸烟等情况^[25]。尤其是休息日的睡眠-觉醒情况的记录更为重要，因为它不受外界时间表的制约，更能反映机体内部计时系统的情况，睡眠日记是评估机体是否存在昼夜节律紊乱的方法之一。但这种方式是个体的主观记录，没有客观的数据作为支撑，且反映的是睡眠情况。虽然睡眠-觉醒受昼夜节律系统的控制，但目前睡眠-觉醒周期的时间并不被认为可作为评估机体昼夜节律的可靠指标，因为睡眠-觉醒周期会受到社交时差的影响，使其与生物钟决定的内部昼夜节律时间不一致^[26]。因此，睡眠日记仅能对昼夜节律做一个简单的评估。

目前市场上常采用无创式睡眠监测技术来评估机体内部的昼夜节律，其中以多导睡眠监测(polysomnography，PSG)为行业标准。它通过多个导联来获取受试者的脑电、心电、呼吸频率、血氧含量以及身体肢体微动与体位等多个生理参数与指标，通过这些数据综合分析，评估受试者的睡眠阶段分布、睡眠时长和深度等相关信息，以此间接反映机体昼夜节律状况^[27]。PSG需要专业医师与技术人员进行操作与实时监控，是医疗级别的睡眠监测技术。虽然多导睡眠监测技术相较于睡眠日记来说，取得了更多的客观数据，但主要的不足仍是间接监测睡眠-觉醒周期，而非直接获取昼夜节律指标。有研究表明，没有任何一种方法能从睡眠-觉醒相关标记物中精确评估昼夜节律^[28]。此外，目前市面上的多导睡眠监测仪价格昂贵，监测时间较长；在监测过程中，受试者身体会连接上很多电极和导线，处于PSG的特殊监测环境中，并非在日常自然睡眠状态下，这也可能会一定程度地影响其睡眠状况，导致结果出现小幅偏差^[29]。

家用睡眠监测仪器利用加速传感器技术及非接触类的睡眠监测等多种方式，可自行居家检测。加速度传感器监测技术类产品都是通过监测使用者的运动状态来评估睡眠-觉醒周期，因为当人处于浅度睡眠时期，会伴随不同程度的神经传递活动，表现在肢体上则是不同程度的无意识抖动与翻身等情况，通过分析使用者睡眠时无意识的体动，利用后台数据算法来分析出睡眠-觉醒周期、睡眠质量与睡眠阶段等各种情况^[30]。非接触式睡眠-觉醒周期监测可以通过压力传感器来实现，通过使用含微动敏感传感器的床垫或者将含有压力传感器的睡眠产品置于床单下，监测受试者的体动、脉搏与心脏跳动以及呼吸动作等压力值的变化，并将其变化转换为医学数据输出，实现对睡眠情况的记录^[31-32]。基于雷达微波技术的睡眠监测技术也属于非接触类，主要运用微波多普勒原理，在一定的近距离范围内监测到使用者睡眠过程中所发出的微弱生理信号，获得如心率、呼吸频率、身体的轻微抖动、翻身等一系列体动数据并记录分析，通过预设的数据模型与算法，来分析确定使用者的睡眠情况^[33]。这些监测方式同多导睡眠监测技术的缺点一样，是通过睡眠-觉醒周期来间接反映机体昼夜节律情况的，且采用的算法各不相同，最终的结果对睡眠-觉醒情况的界定也没有统一的标准；但这一类的睡眠监测产品的优点在于使用方便、过程简洁，不需要额外的医生给出诊断结果，适用于普通人群了解自己的睡眠状况，相较于睡眠日记也更为客观，可以在一定程度上反映昼夜节律情况。

SCN作为昼夜节律中枢起搏器，因无法直接评估其本身固有的周期、振幅和相位等，于是选择出了一些直接或间接受到SCN调节且能够反映昼夜节律时间的外周标记物。但是这些标记物的选择受到了多种因素的影响，比如评估的可靠性、难易程度等，其中外周节律如核心体温、褪黑素和皮质醇分泌节律已被广泛作为反映机体昼夜节律的单变量指标。

内源性褪黑素分泌节律被认为能准确地反映机体内部的昼夜节律时间，因为松果体分泌褪黑素受到了SCN的调控，目前DLMO是最可靠的内部昼夜节律时间记录手段，它已成为衡量身体内部时间的金标准^[34]。DLMO是指在习惯性睡眠时间前2 ~ 3 h，采样者取半卧位或坐位，记录机体褪黑素水平在弱光(< 30 lx)条件下开始释放的时间^[24]。该时间必须在弱光下测量，要求受试者身体活动维持在一个非常低的水平，通常在习惯性就寝前约6 h内，每隔0.5 h或1 h采集血液或唾液样本，随后对样本进行褪黑素浓度测定^[34]。随着检测技术的发展，尿中6-硫氧基褪黑素也已成功应用于生物节律的评估^[35]。尽管DLMO目前已成为衡量身体内部时间的金标准，但在实践中仍存在一些问题：首先，它只能反映中枢时钟的相位变化。其次，样本采集的时间其实是根据既往经验来选择的，当存在特殊情况时，如非24 h睡眠-觉醒周期紊乱、轮班工作等，实际采样过程仍需根据24 h的时间点来捕捉暗光褪黑素释放的时间。此外，DLMO要求受试者必须在受控的条件下进行测量，比如光线、进食、姿势等，且需要连续监测，采样过程相对繁琐，检测成本也相对高昂。基于此，目前已经出现了利用神经网络模型，通过体动记录仪数据来估计DLMO的方法，然而这种方法由于控制了参与者的睡眠-觉醒时间表，其准确度高度依赖于DLMO和睡眠开始之间的时间，在昼夜节律紊乱人群中的评估效率仍有待提升^[36]。

在采用褪黑素对生物节律进行监测之前，核心体温是监测昼夜节律最常用的指标。核心体温监测是需要连续测量受试者直肠温度，该方法要求受试者保持清醒、镇静，并在近乎黑暗的环境中保持半卧位，进食饮水平均分布在监测周期中，因为睡眠-觉醒周期对核心体温有直接影响，光照、活动、姿势、进食等均会对受试者核心体温数据产生遮蔽或诱发效应^[37]。还有值得注意的一点是，虽然昼夜节律起搏器影响着核心体温，但它可能不是主要调节机制，因为体温受到体温调节中枢-下丘脑的反馈性调节。

皮质醇监测方式基本同前，在昏暗条件下，受试者以半卧姿势保持清醒，并且严格遵守体位和活动水平的要求，通过连续采集血液，来检测皮质醇浓度^[38]。光照、活动、睡眠等也会对皮质醇分泌的模式或浓度产生影响，因此要注意对试验条件的控制，尤其要注意的是样本采集时应激的影响。

总的来说，这些外周标记物只能通过时间序列的收集来反映机体昼夜节律的状态，且时间序列应足够长，以确保包含昼夜节律的各个阶段。总之，外周单变量标记可用于评估机体内部昼夜节律，但它们需要精心控制实验条件，只有当环境和行为的掩蔽效应得到充分控制时，这些外周标记物(褪黑素、核心体温和皮质醇)才能用于评估内部昼夜节律状态；而且需要在较长时间内重复采集样本，价格昂贵且检测措施密集，通常对测试者和受试者都是很大的负担。

褪黑素、核心体温和皮质醇是目前机体昼夜节律检测常用的3个指标，其中褪黑素最为常用。首先，视网膜-下丘脑-松果体通路将光信号从眼睛传递到SCN，并通过下丘脑传到松果体，且松果体中没有储存褪黑素，所有合成的褪黑素都会被释放，因此，光线引导的昼夜节律变化直接影响着褪黑素的分泌。其次，睡眠作为昼夜节律最直接的外部反应，褪黑素又与其密切相关，因此临床上无论是睡眠障碍还是昼夜节律紊乱，褪黑素分泌异常都是很重要的诊断指标之一。而皮质醇除了通过交感神经通路受光照影响外，也受下丘脑-垂体-肾上腺轴影响，核心体温则会受到体温调节中枢的控制。因此基于以上情况，皮质醇和核心体温虽然也可以用来衡量昼夜节律有无紊乱，但不如褪黑素应用广泛。

近年来，随着各类组学技术和人工智能技术的不断发展和推广，基于单时间点采样来检测机体内部生物节律时间成为可能。利用代谢组学或者转录组学，使用数学模型或机器语言，检测机体内部时间的手段也日益成熟，并用于个体昼夜节律紊乱的识别和诊断。

采用微阵列技术筛选“时间指示基因”，这些指示基因呈现节律性振荡，分子峰值时间分布在24 h内，满足在正常外界环境12 h光-暗周期和持续黑暗环境下的分子峰值时间彼此相似，并表现出相似的表达模式，这表明筛选出的“时间指示基因”可以排除光照的影响，从而用来指示身体内部生物钟。利用筛选出的“时间指示基因”表达谱，生成最佳拟合余弦函数, 计算出身体内部时间^[39]。这样的方法首先用于小鼠肝脏内部时间的评估，随后基于此方法，研究人员量化了小鼠血浆中数百个时钟基因控制的代谢物，并成功构建了血液代谢物的分子时间表^[40]。之后将这种方法运用于人体，即先测量来自健康受试者的血浆样本中各种代谢物的水平，根据这些数据构建了一个代谢产物的分子时间表，通过分析两个相隔12 h采集的血液样本代谢物，来明确人体的身体内部时间^[41]。通过验证发现，这样的方法能评估轮班工作、时差等环境因素和遗传因素导致的昼夜节律紊乱，但却无法进一步区分。总的来说，分子时间表法比连续时间序列采样更实用，因为只需要少量样本；而且血液作为一种容易采样和分析的样本，有在医院作为常规诊断工具使用的可能。

最初使用昼夜节律基因表达数据集(GSE54650) ^[42]，利用时序性检测的基因表达数据构建矩阵，再用数学方法和机器语言筛选出遵循一定的表达模式的时间指示基因。这种方法分为训练和测试两个步骤，结果表明通过训练队列，ZeitZeiger可以使用远少于分子时间表法的基因数量表达来准确预测多个小鼠器官的昼夜节律时间，这些基因在每个器官中都表现出一致的昼夜节律^[43]。随后采用人类血液全基因组表达数据集，通过测量少量基因的表达，从单一血液样本即可预测机体昼夜节律情况，但局限性在于不是所有的数据集都包含了DLMO在内的个体层面的信息，因此，ZeitZeiger法预测的是一天中外部测量的时间^[44]。随后对ZeitZeiger法进行了部分改良，首先是样本选择了经过睡眠剥夺和自由生活条件下受试者的血液中单核细胞，因为血液中单核细胞是血细胞中相对均一的细胞类型，而且单核细胞时钟基因表达振幅相对明显且较高。其次，将全基因组表达数据确定的候选分子迁移至了NanoString技术，并且同时加入了金标准DLMO作为身体内部时间进行训练^[45]。经验证这种方法提高了检验昼夜节律时间的效能，而且与DLMO有较强的相关性，并且单次采血即可以获得满意的结果。此方法只需检测少数几个基因(≤12个)，相对简单，成本也较低，并且不受时间型的影响；也就是说，这种方法为研究内部昼夜节律的动态变化提供了可能性。然而这种方法却未对昼夜节律本身就存在一定障碍的人群(如老年人、轮班工人等)，以及存在内部昼夜节律不同步等复杂情况进行进一步评估。

通过收集不同睡眠时间条件下的全血转录组数据，通过微阵列技术测量mRNA丰度特征，利用偏最小二乘回归法建立模型[用mRNA丰度值(X)预测昼夜节律相位]，识别了一组100个主要与糖皮质激素信号和免疫功能相关的生物标志物。验证试验表明，当使用一个时间点的样本时，预测与观测的褪黑素阶段相关系数为0.74，而通过改进使用两个相隔12 h的样本，相关系数为0.90 ^[46]。通过偏最小二乘回归法也可实现使用少量血液样本，找到预测昼夜节律阶段的特征，而且该方法无须通过先验知识(文献中已知或数据中心识别的节律表达基因)选择特征，也不受之前的睡眠状况影响。然而不足之处也是在于开展该研究的文献^[46]仅采用了年轻健康个体，所以在正常条件下表现良好的模型可能在非同步条件下表现欠佳。除此之外，通过使用非靶向代谢组学分析睡眠充足和不足的个体血浆代谢组，采用检测的小分子化合物来识别能够预测单个参与者DLMO和暗光褪黑素消退试验(dim-light melatonin offset，DLM offset，被定义为内源性褪黑素浓度降低到预定阈值以下的时间^[47])的候选生物标志物的方法也被开发并得到应用^[48]。它是让每个参与者的血液样本采集时间分别参考DLMO和DLM offset，使用偏最小二乘回归法建立生物标志物模型，因此DLMO和DLM offset的计算是相互独立的。当对睡眠充足、能量平衡的样本进行预测时，与DLMO模型相比，DLM offset模型预测误差显著降低，但血浆代谢物在很大程度上受行为周期的影响，如进食/禁食，睡眠/觉醒，因此，可以考虑用转录组学方法预测DLM offset，以实现对不同生理状况下的个体昼夜节律状况的评估。

通过公共的人类血液转录组数据，时间签名法(time signature)的基本框架包括一个缩放/归一化步骤，使用其中一项微阵列数据进行训练拟合预测器，并用其他两个微阵列数据和RNA-seq分析的新数据进行验证，研究人员研发了一种预测来自不同研究样本内部时间的新方法^[49]。该方法证明一旦对单个研究的数据进行训练，所得到的预测因子可以应用于其他研究的新数据，而不需要对数据进行重整或再训练，并且独立于研究人群、患者方案或分析平台的差异，可以获得准确的结果。由于数据的限制，这种方法的缺陷在于其是根据采样的外部时间验证时间签名来进行分析，但这并不是昼夜节律内部相位的指标。

目前该方法尚处于理论研究阶段，但是该方法对于不同研究样本内部时间的预测可以独立于研究人群、患者方案或分析平台的差异，因此具有较好的实用前景。

综上所述，目前的研究显示不同的指标在监测昼夜节律方面有着各自不同的优缺点和局限性。随着新技术的发展，可以看出昼夜节律的预测方法由传统的褪黑素、睡眠日记等逐渐转向了开发新的生物标记物，具体见表 1。

生物学数据结合机器学习和数学建模为研发量化昼夜节律阶段的新技术提供了巨大的技术支持，然而大多数的方法都是将注意力放在了复杂的算法上，却忽略了筛选出来的标记物的性质与作用。虽然随着研究的深入，一部分工作已经将这些生物标记物与金标准进行了比较，但更多的是在受控的实验室环境中进行验证，然而现实活动和这种被控制的日程存在巨大的差异，因此更有意义的是在现实生活中对大量目标群体进行测试。对于这些指标是否能达成共识还尚未可知，最理想的状态就是这些指标能有一个统一的标准去衡量它们的可靠性、稳定性和敏感性。或许针对广泛的人群和情况，去研发一个通用的方法来评价昼夜节律是不现实的，但是制定针对具体人群或情况的方法或许可行。以时间疗法为例，或许可以通过这些昼夜节律预测模型，直接对特定的组织或者器官进行标记物的识别，或者是在通用的方法下，加上特异性的组织或器官标记物，从而使其成为时间疗法的目标。总之，目前的方法虽然还存在各种缺陷，但至少都为特殊作息职业群体昼夜节律检测提供了新的可能性。